ZEISS Lattice Lightsheet 7

Live Cellの長時間3Dタイムラプスイメージング

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、ライトシート顕微鏡をベースに、生細胞のSubcellularレベルでの解像度の観察を可能にします。もちろん、標準的なサンプルキャリアを使用することができます。この自動化された使いやすいシステムで、細胞內構造および數時間から數日のボリュームイメージングを極低ダメージで行うことができます。生命のダイナミックスをかつて無いほど深く?詳細に想像以上に簡単に探究することができます。

ZEISS Lattice Lightsheet 7

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Learn about the lattice light sheet principle and its advantages for 3D imaging of subcellular dynamics, get insights into the technique's development process, get introduced to ZEISS Lattice Lightsheet 7 and its features, and hear about first customer experiences and applications.

 

生命の細胞內でのダイナミクスを探求

 
  • 驚くほど簡単操作?
    いつものLivingサンプルをそのまま標準的なサンプルキャリアで観察できます
  • 極低ダメージ
    數時間から數日の生體の細胞內のダイナミクスを観察することができます
  • Near-isotropicな分解能
    本來の比で3Dの詳細を観察することができます
  • 高速ボリュームイメージング
    生體內のイベントを逃さず捉えます
  • オートアライメント
    マニュアルでのアライメントの必要はなく、実験にのみフォーカスできます

Lattice Light Sheetテクノロジーを全ての方に

 

細胞內プロセスの研究にとって、極低ダメージで、高分解能なライトシートイメージングの重要性は、どんなに重視してもし過ぎることはありません。ZEISSは、この先進技術のメリットを誰もが享受できるように、Lattice Lightsheet 7を驚くほどシンプルに使用できるよう設計しました。サンプルプレパレーションをシステムに合わせることなく、これまで共焦點顕微鏡観察に使用していたサンプルキャリアを使用してLivingサンプルを観察できます。複雑なマニュアルのアライメントプロセスは必要なく、ユーザーは実験そのものにだけフォーカスすることができます。

 
 

光毒性とブリーチを極限まで抑える

 

微細な構造が時間とともにどのように変化するのかを研究するために、Subcellularレベルでの分解能で生體のダイナミクスを観察しようとすると、従來のイメージングシステムでは、観察対象にダメージが與えられてしまい、すぐに限界に達してしまいます。そこで、ZEISS Lattice Lightsheet 7は、センシティブなサンプルに適応するため、フォトブリーチと光毒性を極めて低減、數時間から數日のイメージングを実現するLattice-Structured (格子構造)の光を採用しています。コントロールされた培養環境と內蔵された自動イマージョン供給システムによって、長時間の実験を行うことができます。

動畫:有糸分裂するLLC-PK1細胞。H2B-mCherry(青)α-Tubulin mEGFP(赤)。25時間以上タイムラプスイメージング。

高速ボリュームイメージング

 

ZEISS Lattice Lightsheet 7は1秒間に3 ボリュームの極めて高速の畫像取得が可能です。この高い時間分解能でサンプルボリューム全體のタイムラプスイメージングを実施すれば、関心イベントを見逃すことはもうありません。XYおよびZでの分解能がほぼ等方であるので、サンプルの詳細な構造を、本來の比で観察することができます。高速なレーザーのスイッチングによって、クロストークを最小限に、最大で3色のほぼ同時のイメージングが可能です。

Video:Cos7細胞 Calnexin-mEmerald および EB3-tdTomato (一過性トランスフェクション)
EB3は微小管の成長端を標識します。これは微小管のダイナミクスの調節のために必要です。カルネキシンは、小胞體のタンパク質です。インターバルは80秒、トータル1.5時間、ボリュームは、175 x 120 x 70 μm3 でのタイムラプスイメージングです。

 

テクノロジー

Lattice Light Sheet 顕微鏡の特長

Lattice Light Sheet 顕微鏡(Gaussian Light Sheet 顕微鏡とも呼ばれる)は、一般的に、優れた高速性と低ダメージでのイメージングで良く知られています。勵起と検出のレンズを分離させるという畫期的なコンセプトによって、サンプルの検出用対物レンズの焦點面にある領域だけを照明することが可能になりました。シート光をサンプル上で移動し、焦點面ごとに1畫像ずつ撮影することによって、焦點面以外のサンプル領域を照射することなく、ボリュームデータを取得することができます。

Light Sheet Microscopy Principle
従來の(Gaussian)ライトシート顕微鏡は、蛍光の勵起と検出を2つの光路に分け、焦點面からの蛍光のみ勵起することで、光學切片を生成します。

Lattice Light Sheet 顕微鏡は、ライトシート顕微鏡のメリットに、共焦點レベルでのほぼ等方の分解能を組み合わせたものです。高度なビーム形成技術により、Lattice(格子)型の光シートを作成します。このLatticeライトシートは標準的なGaussianライトシートに比べて極めて薄く、それによって、高速で、より高い分解能を提供することができます。光シートのLattice(格子)構造は、Spatial Light Modulator(SLM)により作成されます。Lattice(格子)構造を’Dithring’処理してなめらかなライトシートを作成し、スキャナーを通してサンプルに照射します。

Lattice Light Sheet Microscopy Principle
Lattice Light Sheet 顕微鏡は、Gaussianビーム(光學斷層厚および視野の制限)とBesselビーム(強いリング、焦點面以外の蛍光の勵起)の限界を打破し、薄く、長いシート光を形成することによって、Subcellularレベルの分解能を達成します。

ZEISS Lattice Light Sheet 顕微鏡の開発

Lattice Lightsheet 7の開発に際して、ZEISSではユーザーの使い易さとこれまでのサンプルプレパレーションとの互換性を特に考慮しました。倒立型顕微鏡の構成は、一般的なサンプルキャリアを使用しての高分解能イメージングにおいて、最も重要なポイントです。倒立型顕微鏡の構成で生じる課題は、主に屈折率のミスマッチです。サンプルからの蛍光が、水性の培養液を通過し、角度あるカバーガラスを通過し、水浸部分を通過し、そして検出用対物レンズに入るからです。

ZEISS獨自の光學系

検出用光學経路にある、ZEISS獨自の特別な光學素子が、屈折率のミスマッチを補正するので、共焦點顕微鏡と同じくらい簡単かつ迅速に、畫像取得ができます。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 Optics
概要:サンプルキャリアと光學系。勵起用対物レンズ(1)、メニスカスレンズ(2)、Free-Form Opticsを有した検出用対物レンズ(3)。(A)は、屈折率補正なしの畫像例、(B)は、屈折率補正ありの畫像例です。

特長

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Incubation Chamber
35mmディッシュが設置されたインキュベーションチャンバ

標準的なサンプルキャリアが使用可能

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Incubation Chamber
Incubation chamber loaded with a standard 35 mm dish.

サンプルプレパレーションの変更の必要はなく、これまで、共焦點顕微鏡で使用していたサンプルキャリアを使用し、Liveサンプルのイメージングが可能です。ZEISS Lattice Lightsheet 7は、No.1.5のカバーガラスを使用した様々なサンプルキャリアを使用することができます。

  • スライド
  • 35mmディッシュ
  • チャンバスライド
  • マルチウェルプレート
ZEISS Lattice Lightsheet 7 - LED Illumination
透過光観察でサンプルに優しく、迅速な撮影位置の決定を可能にします。

迅速かつサンプルに優しい位置決め

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - LED Illumination
Gentle transmission illumination ensures that your sample is quickly located.

內蔵された透過型LEDとOblique検出により、DICのようなコントラストの畫像で、サンプルの位置決めを容易に行うことができます。必要に応じて、透過用LEDを白色から赤色に切り替えて、照明をよりサンプルに優しいものに変更できます。また、長期間の観察中、透過光を含めることを選択することができます。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 5-axis Stage
5軸のステージによって、マルチウェルプレート撮影時などの広い移動範囲でも、最高の精度と観察速度を両立できます

サンプルの位置調整

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 5-axis Stage
The 5-axis stage combines highest precision and speed with a large travel range for multiwell plate imaging.

このシステムのために設計された、獨自の5軸ステージは、X軸、Y軸、Z軸に沿った動きだけではなく、X軸およびY軸での傾きにも高い精度で対応しています。これによって、サンプルキャリアの大きさやサンプル位置のわずかな誤差を補正することができます。サンプルのレベリングで、面倒な手動プロセスはありません。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Beam Path
ZEISS Lattice Lightsheet 7の光路概要(クリックすると拡大表示されます)

光學素子アライメント

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Beampath
Schematic of the ZEISS Lattice Lightsheet 7 beam path (click to enlarge).

ベストなイメージング結果を得るためには、lattice light sheetをサンプルごとに最適化する必要があります。そこでZEISSは光學素子のオートアライメント機能を付與し、時間のかかるマニュアルでの調整を省きました。革新的な勵起レーザーの光路デザインによって、SLMの再プログラミング無しで、レーザーラインの切替を高速に行うことができます。これにより、マルチチャンネルのデータセットをほぼ同時に取得することができ、サンプルに起こったどんなイベントも見逃すことがなくなります。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Autoimmersion
ZEISS Lattice Lightsheet 7自動イマージョン供給システム

長期間の観察

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - Autoimmersion
ZEISS Lattice Lightsheet 7 autoimmersion equipment.

インキュベーション

インキュベーションシステムが內蔵されており、様々な環境設定を、安定的に長期にわたって保持します。システムが溫度、CO2、O2のレベル、および濕度を自動的にモニターし、コントロールするので、観察中、サンプルの狀態が最善に保たれます。蓋部分にガラス窓があり、実験中にサンプルを簡単にチェックすることができます。

自動イマージョン供給システム

空気を除去し、サンプルに適したイマージョンの供給を自動的に行うことができます。イマージョンの補充はソフトウェアによってコントロールされているので、畫像取得との干渉を心配する必要はありません。イマージョン補給容器は照明が當たらないように保護されているので、バクテリアの繁殖が抑えられます。対物レンズはイマージョンと觸れない様に保護されているので、たとえ過剰な量のイマージョンが供給されてもドライの狀態が保たれます。


代表的なアプリケーション

代表的なアプリケーション
代表的なサンプル
タスク

Live Cell イメージング

  • 接著細胞
  • 浮遊細胞
  • 高速でのSubcellularレベルでのボリューム測定イメージング:細胞小器官の形態學やダイナミクス、細胞小器官間相互作用、小胞輸送
  • 膜動態のボリューム測定イメージング
  • 免疫細胞のボリューム測定イメージング(T細胞の動きおよび活性化など)
  • 數時間?數日にわたる極低ダメージでのLive Cellイメージング(最小限の光毒性と退色)
  • 細胞増殖とアポトーシスの解析

3D細胞培養

  • スフェロイド
  • オルガノイド
  • 囊胞
  • ヒドロゲル內の細胞
  • 直徑200μmまでのスフェロイドやオルガノイドのライブイメージング
  • オルガノイドの自己組織化
  • オルガノイド內での細胞遊走および増殖
  • 細胞間相互作用、3D構成、移動、形態のイメージング
  • Vitroでのニューロンの活動

小型モデル生物

  • ゼブラフィッシュ 胚
  • C.elegans 胚
  • ショウジョウバエ 胚
  • 3Dで構造の詳細をほぼ等方の分解能で解像
  • 直徑100μmまでの胚や小生物における細胞および細胞內のダイナミックスの高速イメージング
  • 細胞遊走、細胞間相互作用、細胞周期、小胞輸送

卵母細胞

?

  • 卵母細胞全體の細胞の詳細を含む3Dライブイメージング

エクスパンド サンプル

?

  • 水ベースのゲルエクスパンディット小型サンプル

ZEISS Lattice Lightsheet 7 at Work

Lamin B1 in Action

 

Lamin B1 は、核膜に局在し、有糸分裂中の核膜の分解および再形成に関與します。これまで、有糸分裂中の様々な細胞周期のステージにおいて、いわゆる「核膜陥入」が各種の細胞で形成されることが報告されてきました。核膜陥入は、核膜から伸びて核を橫斷する管狀構造として現れることがあります。これらのユニークな構造はたびたび報告されていますが、これまでのほとんどの研究は固定細胞で行われてきました。そのため、多くの仮説が提唱されているにも関わらず、これらの構造の機能はほとんど知られていません

このデータセットは、米國ワシントン州シアトルのAllen Institute for Cell Science(アレン細胞科學研究所)からご提供頂いた細胞株を使って記録されたものでmEGFP-tagged Lamin B1を內因的に発現した、ヒト由來のiPS細胞(AICS-0013)です。1つのボリュームを1.5分毎、トータルで約8時間のイメージング。有糸分裂を起こしている細胞を全期間通して観察することができています。核陥入の形成と動きを、細胞周期全體を通して、ほとんどの細胞で明確に観察することができています。

有糸分裂のプロセスは非常に繊細で光に敏感であるため、イメージングには優しい照明が欠かせません。損傷したDNAが複製されるのを回避するため、細胞は、勵起光による損傷があると直ちに有糸分裂を停止します。長時間にわたる有糸分裂イベントの撮像には、Lattice Lightsheet 7による極低ダメージのイメージングとシステムの安定性が求められます。ほぼ等方性の分解能と高速ボリュームイメージングの組み合わせにより、あらゆる角度からサンプルを観察することができ、ユニークな細胞內構造を詳細に観察することができます。ZEISS Lattice Lightsheet 7はこのような挑戦的な実験に最適なツールです。以前は不可能だったアプリケーションが、現実的なものになります。また、使い易いシステムであるため、研究に簡単に導入することができます。

細胞內の動きを最高のボリュームスピードで

 

Cos7細胞 Calnexin-mEmerald および EB3-tdTomato (一過性トランスフェクション)
EB3は微小管の成長端を標識し、微小管の動きの調節に必要です。カルネキシンは、小胞體のタンパク質です。細胞は、80秒毎に1.5時間にわたって撮影されました。撮像されたボリュームは?175 × 120 × 70 μm3。

 

Actin-GFP(細胞骨格, シアン)を安定的に発現しているU2OS細胞のタイムラプスイメージング。MitoTracker? Red CMXRos(ミトコンドリア、緑色)およびDraq 5(核、赤色)でも標識されています。

 

Cos7 細胞、Tomm20-mEmeraldおよびCalreticulin-tdTomato(一過性トランスフェクション)Tomm20はミトコンドリアの外膜を標識します。カルレチキュリンは、タンパク質が合成される小胞體のタンパク質です。どちらも非常に繊細で光感受性が高い、細胞小器官で、従來の方法での畫像取得は困難です。1つのボリュームを30秒毎、トータル1時間15分のタイムラプスイメージングです。撮像されたボリュームは、175 × 210 × 20 μm3 です。150タイムポイントで、572ボリュームプレーン、合計で85,800枚の畫像取得。

 

Lifeact-GFPを発現するCos7細胞。最大輝度投影法(Maximum intensity Projection)。細胞は10秒あたり1ボリューム(115 × 60 × 25 μm3)、トータル9時間の連続畫像取得。5,000タイムポイントで201ボリュームプレーン、合計で1,005,000枚の畫像取得。

 
 

Cos7細胞、mEmerald-Rab5aおよびGolgi7-tdTomatoで標識(一過性トランスフェクション)。Golgi7は、ゴルジおよびゴルジ小胞に関連するタンパク質。Rab5aは、初期エンドソームのマーカー。ほぼ等方の分解能で小胞を3Dでトラッキングを実現。トラッキングは、arivis Vision4D?ソフトウェアを使用。

 

T細胞、Lifeact-GFPを発現。左:カラーコード処理したDepth Projection、右:最大輝度投影法 Maximum Intensity Projection。1ボリュームを2.5秒毎、1時間以上にわたって畫像取得。サンプルご提供: M. Fritzsche, University of Oxford, UK.

初期発生 | 卵母細胞

 

マウス卵核胞期卵母細胞(固定)。核膜(抗ラミン、シアン)、アクチン(ファロイジン、マゼンダ)、微小管(抗チューブリン、黃色)。微小管およびアクチン構造の高分解能イメージングには、Sinc3 15 × 650 Lattice ライトシートを使用。動畫では、微小管の3D構造がご覧いただけます。サンプルご提供: C. So, MPI G?ttingen, Germany.

 

マウス卵核胞期卵母細胞(固定)。核膜(抗ラミン、シアン)、アクチン(ファロイジン、マゼンダ)、微小管(抗チューブリン、黃色)。卵母細胞全體のイメージングには、Sinc3 100 × 1,800 Lattieライトシートを使用。サンプルご提供: C. So, MPI G?ttingen, Germany.

 

マウス第二分裂中期で停止させたマウス卵細胞。ミトコンドリア(シアン)、微小管(マゼンダ)、染色體(黃色)。サンプルご提供: C. So, MPI G?ttingen, Germany.

小型生物の発生 | ゼブラフィッシュ

 

DeltaD-YFPトランスジェニック ゼブラフィッシュ胚(Liao et al. 2016, Nature Communications)。內因性調節領域を含む導入遺伝子により誘導される融合タンパク質。尾芽と未分節中胚葉に発現。細胞皮質と輸送小胞に対応する點(緑)が確認できる。核は(マゼンダ)。8秒毎に、1ボリューム(150 × 50 × 90 μm3)、トータル5分間。サンプルご提供: Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland.

 

ゼブラフィッシュ胚の高速動畫。輸送mRNA分子(緑色)、核(マゼンダ)のボリュームイメージング。最大輝度投影法(Maximum Intensity Projection)1ボリューム(86 × 80 × 12 μm3)を2.5秒毎にデータ取得。サンプルご提供: Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland.

 

mRNA分子を、arivis Vision4D?ソフトウェアでトラックしました。核のトラックをリファレンスとして、ゼブラフィッシュ胚の動きを補正し、mRNA分子を個別に一定時間追跡し、その速度や方向などの統計データを取得しました。サンプルご提供: Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland.

小型生物の発生 | C.elegans胚

 

核を染色したC.elegans胚。カラーコード処理されたDepth Projetionで表示しています。1ボリューム 700ミリ秒毎に、トータル10分以上データ取得。1ボリュームは、115 × 50 × 30 μm3、101ボリュームを1000タイムポイントで撮影、合計101,000枚のデータを取得。

 

核を染色したC.elegans胚。胚をカラーコード処理されたDepth Projectionで表示。5分毎に19時間余以上データ取得。通常の睡眠?覚醒サイクルを観察できています。撮像ボリューム:115 x 50 x 30 μm3 。101ボリュームを236タイムポイントで撮影、合計で23,836枚のデータを取得。

 

後期bean 期(受精後400分未満)のC.elegans 胚。560未満の核をHIS-58::mCherryで標識(マゼンダ)とGFP::SAS-7で標識された中心小體(緑)。有糸分裂中の細胞で、紡錘體のHIS-58::mCherryと中心小體の凝集シグナルを示しています。サンプルご提供: N. Kalbfuss, G?ncy Lab, EPFL, Switzerland.

小型生物の発生 | ショウジョウバエ胚

 
 

キイロショウジョウバエは、生物醫學など多くの研究分野で用いられるモデル生物です。多くの遺伝子組み換え変異體が研究に用いられています。このムービーは、GFPで標識されたショウジョウバエ胚の経時的な動きが示されています。1ボリューム300 × 455 × 145 μm3、15秒毎に25分間撮影。911ボリュームを100タイムポイントでデータ取得。合計91,100枚のデータを取得。

3D細胞モデルの形成

 

スフェロイドとオルガノイドは、組織のin vitroモデルです。組織そのものよりもはるかに小さく、シンプルですが、簡単に作成できるため、発生生物學者にとって、組織の成長を研究するための貴重なツールとされています。細胞の単層のみで構成される細胞培養とは異なり、スフェロイド/オルガノイドの細胞は3次元構造を形成します。そのため、これを用いて3D細胞モデル內での細胞の遊走や分化過程の研究をすることができます。Lattieライトシート顕微鏡を用いれば、オルガノイドの成長と自己組織化のイメージングが現実的なものになります。ここでは、H2B-mCherry(シアン)とα-Tubulin-mEGFP(マゼンダ)を発現する細胞を含むスフェロイドの3Dレンダリングデータです。標識されていない細胞もあります。

植物と種子の成長 | 花粉粒と花粉管

 

花粉管內のミトコンドリアのダイナミクスの観察。ミトコンドリアが、花粉管端部で先端に向かって移動し、花粉管の中央に戻ります。移動中、修復プロセスおよび生體分子を共有し分配するために、ミトコンドリアは融合?分裂します。サンプルご提供: R. Whan, UNSW, Sydney, Australia.

 

ミトコンドリア(MitoTracker Green、緑)およびリソソーム(Lysotracker Red、赤)を染色した花粉管。花粉管が花粉粒の亀裂から伸びているのが観察できます。(自発蛍光によって視覚化)。ミトコンドリアは、花粉管の先端まで完全に進むわけではなく、先端の數ミクロン手前の位置で停止します。データセットのレンダリングは、arivisVision4D?を使用。サンプルご提供: R. Whan, UNSW, Sydney, Australia.

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ZEISS Lattice Lightsheet 7

生體細胞の長時間ボリュームイメージング

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